http://www.cdc.go.kr/CDC/cms/content/95/20995_view.html
Development and application of cell penetrating peptides.pdf
Development and application of cell penetrating peptides
I. 들어가는 말
질환의 타깃(Target)이 세포 내부에 있는 경우에 약물의 세포내 전달은 질병 치료, 예방, 진단 등을 위해 반드시 선결되어야 하는 문제이다. 효과적인 세포내 약물전달을 위해 리포좀 등과 같은 약물 전달체에 의한 연구가 시도되어 왔지만, 생체의 면역계에 의한 빠른 소실이나, 세포와의 상호작용으로 인한 장애 등의 개선해야할 문제점이 많이 남아있다. 이를 위해 최근 세포막을 파괴하지 않으며, 세포 독성을 나타내지 않고 세포의 생체막과 핵막을 통해 친수성 거대 분자를 전달하려는 연구가 이루어지고 있다. 이러한 물질로 세포막 투과성 펩타이드가 발견되어 많은 연구가 수행되고 있다.
세포 투과 펩타이드(Cell Penetrating Peptides, CPP)는 약 10-30개 정도의 짧은 세포막 투과성 펩타이드로 대부분 단백질-투과 도메인(Protein-Transduction Domain, PTD)이나 막-이동 시퀀스 (Membrane-Translocating Sequence, MTS)로부터 유도되었다. 이러한 이유로 CPP는 PTD 혹은 MTS로 칭하기도 한다. 일반적인 외부 물질의 세포 내 유입 경로와는 달리 CPP는 세포막에 손상을 주지 않으면서도 세포 내로 이동하고, 세포막을 통과하지 못하는 DNA나 분자량이 큰 단백질까지도 세포 내로 전달시킬 수 있는 획기적인 역할을 하는 물질로서 1990년대 이후 많은 연구가 진행되고 있다[1, 2].
CPP를 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결시켰을 경우에도 융합 단백질을 효율적으로 세포 내로 수송하는 것이 밝혀진 이후 CPP를 이용한 다양한 응용이 시도되고 있다. 대부분이 Tat CPP를 이용하여 원하는 단백질, 핵산, 약물 등을 원하는 세포 내로 수송하는 데 초점이 모아지고 있다. 최근에는 역분화줄기세포(iPC; induced Pluripotent Cell)를 유도하기 위한 전사인자의 세포내 도입을 위해 CPP와 융합된 전사인자를 세포에 적용하여 iPC의 유도를 성공한 사례가 보고되었다. 이러한 CPP를 이용하여 iPC 유도 전사인자 단백질을 직접 세포내로 도입하게 되면, 대부분 발암유전자(oncogene)인 iPC 유도 전사인자를 유전자 상태로 세포에 도입하는 것 보다 안전하여 유도된 iPC를 난치성 질환에 적용하는 것을 용이하게 하여준다[3].
현재 약 50여 개 정도의 다양한 단백질 유래의 CPP가 보고되었고, 이들이 세포 안으로 들어가는 정확한 기작은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 일부 CPP를 사용한 연구에서 일반적인 외부 물질이 세포내 유입 시 세포 내의 엔도좀에 갇혀 있다가 라이소좀에 의해 분해되어 세포질에 흡수되는 것과는 달리, 엔도싸이토시스(endocytosis)에 의해 세포내에 유입된 CPP는 엔도좀을 탈출하여 라이소좀에 의해 분해되는 것을 회피하여 세포내로 유입 되는 것으로 밝혀져 있다. 한편, 현재까지 알려진 막 투과성을 보유한 기능성 펩타이드들 간의 주된 차이점은 외부 단백질을 융합시킬 수 있는 크기에 대한 제한성을 들 수 있다.
Antp CPP의 경우는 아미노산 100개 미만 길이의 단백질만 융합 가능한 반면, Tat 및 VP22의 경우는 1,000개 이상의 아미노산으로 구성된 단백질까지도 융합이 가능한 것으로 알려져 있다[4].
본 글에서는 이러한 생물학적 의학적으로 활용가치가 높은 CPP에 대한 최근 연구동향 및 활용 사례에 대한 내용을 소개하고자 한다.
II. 몸 말
1. 세포투과성 펩타이드란?
지난 20여 년 동안 세포막을 투과하여 세포내로 들어갈 수 있는 다양한 종류의 펩타이드가 연구되어 CPP 혹은 PTD, MTS 등으로 알려져 왔다. 이러한 CPP는 세포투과성에 있어 세포에 독성을 가하지 않고 에너지를 사용하지 않으며 특정한 세포막의 수용체를 거치지 않고 비교적 자유롭게 세포내로 들어갈 수 있을 뿐만 아니라, CPP에 연결된 물질 역시 세포내로 효과적으로 운반할 수 있는 특성이 있는 것으로 보고되고 있다[1].
CPP는 보통 10-30개의 짧은 아미노산으로 구성되어 있으며, 아미노산 서열이 각각의 CPP에 따라 다양하나 대부분 염기성의 아미노산(basic amino acids, lysine and arginine)을 많이 포함하고 있으며, 일부는 양쪽성 알파사슬 구조(amphipathic alpha-helical structure)를 나타낸다. HIV-1 유래의 Tat 단백질, 초파리의 안테나페디아 단백질(Antennapedia protein)의 호메오도메인 유래의 CPP(각각 Tat, Penetratin)가 인위적으로 디자인한 CPP인 Pep-1함께 가장 연구가 많이 되어 있으며 이러한 CPP의 특성은 세포막의 투과가 용이하지 않은 다양한 물질(단백질, DNA, RNA, peptide)을 세포내로 도입하여 질환의 치료에 적용하는 등 다양한 연구가 이루어지고 있다[4].
Tat는 86개의 아미노산으로 이루어진 후천성면역결핍증후군을 발생시키는 HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 전사인자로 감염된 세포에서 HIV-1의 전사 및 복제를 유도하고 휴지기에 있는 바이러스를 재활성화 시키는 단백질이다. 이들 아미노산중 RKKKRRQRRR(Tat 49-57, 이하 Tat)이 CPP의 역할을 하는 최소 부위로 알려져 있고 최초로 발견되어 실제 가장 많은 연구에 사용되었다. Tat의 아미노산을 치환시키거나 결실시키는 실험을 통해 arginine이나 lysine이 Tat가 CPP로서 세포내로 투과하는 효율을 결정하는 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌다. 또한 다중의 Tat를 사용하면 리포좀과 같은 보다 큰 물질을 세포내로 운반할 수 있다[2].
Antp(antennapedia protein)은 초파리의 배아 발생 시 형태 형성에 관여하는 전사인자로 알려진 호메오단백질로 초파리 이외의 다른 종에서도 호메오단백질이 존재하며 여러 종간에 호메오단백질 내의 호메오도메인에 60개의 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 지닌 helix-turn-helix 구조를 가지고 있다. 이러한 구조가 Antp에서 유래한 펩타이드의 세포투과성에 중요한 역할을 할 것으로 생각되며, 호메오도메인의 3째 helix에 위치한 RQIKIWFQNRRMKWKK는 초파리와 사람에서 동일한 아미노산 서열을 가지며 세포투과성에 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. 또한 호메오도메인은 DNA와 결합할 수 있는 구조를 지니고 있어 현재 Antp유래 CPP는 penetratin이란 이름으로 상용화되어 분자생물학 연구에 사용되는 유전자 DNA(주로 plasmid DNA)를 진핵세포에 도입하는 트랜스펙션 시약으로 판매되고 있다[1, 3].
바이러스나 초파리 유래 단백질에서 유도된 CPP의 경우 치료제 등으로 개발되어 인체에 적용할 때 CPP에 대한 면역반응을 유도할 가능성이 있고, 이렇게 유도된 면역반응은 같은 CPP를 반복적으로 투여할 때 그 효능이 반감 혹은 소실될 수 있다. 이러한 가능성을 배제하기 위해 인체의 단백체에서 CPP를 찾아내고, 이를 이용하려는 연구가 많이 진행되고 있다. 실제로 인간이 가지고 있는 몇몇 단백질에서 CPP기능을 하는 아미노산 서열이 밝혀졌는데, 이들 중 하나가 세포내 산소의 농도를 인식하여 관련 유전자의 발현을 조절하는 전사인자인 HIF-1 단백질의 발현 후 수식(modification)을 담당하는 Hph-1 또한 CPP로서 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 인체 단백질인 Hox-A5의 호메오도메인은 초파리 호메오단백질 Antp과 91%의 유사성을 지니며 특히 RQIKIWFQNRRMKWKK 부위는 세포투과성을 지니는 것으로 초파리의 호메오단백질에서 발견된 것과 서열이 동일하며, 이부분은 Hox-A5 뿐만 아니라 Hox-A4, Hox-B5, Hox-B7, Hox-D3, GAX, MOX-2와 같은 사람의 다른 호메오단백질에서 발견되는 것으로 보아 호메오단백질에서도 중요한 역할을 할 것으로 생각된다 [1].
기존에 밝혀진 CPP의 아미노산 서열을 기반으로 하여 보다 효과적으로 세포막을 통과할 수 있는 새로운 PTD를 만들려는 시도가 진행되고 있다. 대부분의 경우 염기성 아미노산인 Lysine이나 Arginine과 같은 양 전하를 띄는 서열을 첨가하여 만들어졌다. 그 예로는 R9(RRRRRRRRR)이나 R11(RRRRRRRRRRR)와 같은 경우 Arginine만으로 이루어져 CPP로의 역할을 하는 것이 밝혀졌으며, 가장 잘 알려진 인공 합성 CPP로 transportan이 있다. Transportan은 galanin 수용체 리간드인 galanin 뉴로펩타이드의 12개 아미노산 서열과 G-protein을 활성화시키며, 세포독성이 있는 mastoparan 펩타이드의 14개 아미노산 서열이 연결된 카이메라 펩타이드이다. 실험 결과 transportan에서 AGYLLGKINLKALAALAKKIL 부위가 세포투과성에 필요한 부분임이 밝혀졌다. Mastoparan은 세포막에 구멍을 내는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. Mastoparan과 galanin을 서로 결합한 transportan은 세포막에 구멍을 내는 능력뿐만 아니라 수용체와 결합하는 능력을 모두 가짐으로서 세포막을 투과하는 성질을 갖는 것이라 생각된다[1,2].
2. 세포투과성 펩타이드의 세포투과기전
분자량 약 200이상이며 친수성의 물질은 세포내로 자유롭게 이동하지 못한다. 이러한 고분자 혹은 친수성 물질이 세포 외부에서 세포 내부로 이동하는 경우는 세포 자체의 엔도싸이토시스에 의해 능동적으로 운반되는 것으로 알려져 있다. CPP의 경우 친수성과 소수성의 다양한 잔기를 갖는 10-30개의 아미노산으로 이루어진 분자량이 1,000-3,000의 물질로 엔도싸이토시스에 의해 세포내로 수송되는 것으로 추정되어 이를 규명하기 위한 연구가 수행되었다. 초기 실험에서는 CPP를 세포의 엔도싸이토시스가 저해되는 낮은 온도, 혹은 엔도싸이토시스 저해제를 처리한 세포를 이용한 실험에서도 CPP가 세포내로 투과되어 존재함을 확인하였다. 따라서 초기 연구에서는 CPP의 세포내 투과성이 엔도싸이토시스와는 무관하게 일어나는 것으로 생각했다[2, 4].
한편, D-enantiomer(거울상이성질체)를 사용하거나 역순의 아미노산 서열을 갖는 CPP를 사용하여 실험한 결과 L-enantiomer와 바른 순서를 갖는 CPP와 비교하여 세포내 투과성을 측정한 결과 큰 차이를 나타내지 않은 것으로 보아 특정한 세포막의 수용체가 CPP의 세포내 유입에 관여하지 않는 것으로 생각된다. 이후 일부 CPP를 사용한 몇몇 연구에서 수용체와 에너지 비의존적으로 일어나는 것으로 생각되는 CPP 펩타이드의 세포내 투과성이 형광이나 방사선으로 표지된 CPP를 세포에 처리하고, 이러한 세포내에 형광이나 방사선의 잔류 양을 측정하여 CPP의 세포내 투과 정도를 측정하는 실험에서 세포를 고정(Cell fixation)하는 과정에서 발생하는 실험적 오류일 수 있는 것이 확인되었다. 형광이나 방사선이 표지된 CPP 펩타이드가 세포내에 투과되지 않고 세포막에 결합한 상태로 고정되어 이후 실험과정에서 모두 제거되지 않아 CPP가 세포내에 투과되어 있는 것으로 오판하는 결과를 초래할 수 있는 것으로 확인되었다. 이외에도 CPP의 세포투과기전에 대한 다양한 가설이 존재하며, CPP의 종류에 따른 아미노산 서열의 구성과 세포에 처리한 농도에 따라 그 세포투과기전이 다를 것으로 생각되고 있다[2, 4].
세포외부의 물질이 세포내부로 수송되는 기전은 직접투과와 엔도싸이토시스로 나뉘며, 이전의 직접세포투과기전에 대한 연구는 항생 펩타이드에서 많은 연구가 되어 왔다. 항생 펩타이드는 미생물의 세포막에 대한 특이적인 작용을 통해 항생 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 항생 펩타이드의 세포막에 대한 작용 및 투과기전은 직접투과기전으로 크게 ‘barrel-stave’, ‘carpet’, ‘toroidal-pore’의 세 가지 모델로 구분될 수 있다. ‘barrel-stave’ 모델은 세포막에 붙은 helix 구조를 갖는 다수의 펩타이드가 축적이 되고 세포막으로 함입되어 펩타이드의 소수성 부분이 세포막의 지질과 결합하여 펩타이드가 세포막을 관통하는 구멍을 형성하게 된다.
이러한 세포막의 구멍을 통해 세포 외부의 물질이 세포내로의 전달이 가능하게 된다. ‘carpet’ 모델은 펩타이드의 양전하를 갖는 부분이 세포막의 음이온성 인지질의 머리 부분에 결합하여 세포막 표면을 카페트처럼 덮는다. 이 경우, 세포막의 국소 지역에 펩타이드의 농도가 높아지면 펩타이드는 detergent의 역할을 하여 세포막에 마이쉘(micelles)을 형성하게 하여 세포막이 이중막 구조를 파괴하여 펩타이드가 세포 내로 침투하게 된다. ‘toroidal-pore’ 모델은 헬릭스 구조를 갖는 펩타이드가 세포막으로 침투하여 세포막 지질층이 왜곡되도록 하여 세포막에 구멍이 형성되는 것으로 물리적으로 세포막의 기능이 상실되어 펩타이드 및 세포외부의 물질이 세포내로 투과하는 모델이다. 이러한 펩타이드에 의한 세포외부의 물질의 세포내 전달 기전은 펩타이드가 양쪽성 헬릭스구조를 갖는 경우에 설명이 용이하며 일부 CPP의 경우 이러한 양쪽성 헬릭스구조를 갖는 경우가 있어 이러한 방식으로 CPP의 세포내 수송 기전의 일부를 설명할 수 있으리라 생각된다.
그러나, ‘barrel-stave’, ‘carpet’, ‘toroidal-pore’ 세가지 모델에 의해 세포외부의 물질이 세포 내부로 유입이 될 경우 세포막을 불안정하게 만들며, 세포막에 손상을 주어 세포독성을 나타내는 경우가 많다. 대부분의 CPP의 경우 다양한 크기의 전달물질과 결합하여 세포내부로 투과 혹은 이동시 독성을 나타내지 않는다. 이러한 사실로 보아 위의 모델에서 단지 CPP의 세포내 수송되는 기전의 일부만을 설명하는 것으로 생각되고 있다[4].
최근의 연구 결과에서는 CPP가 세포내 수송이 엔도싸이토시스 작용과 연관이 있음이 밝혀졌다. 엔도싸이토시스는 크게 파고싸이토시스(phagocytosis)와 피노싸이토시스(pinocytosis) 2가지로 구분되며, 파고싸이토시스는 주로 마크로파지(macrophage)와 같은 특정한 세포에서 일어나며, 피노싸이토시스(pinocytosis)는 대부분의 세포에서 일어나며 마크로피노싸이토시스(macropinocytosis), clathrin 매개 엔도싸이토시스, cavelolae 매개 엔도싸이토시스가 이에 속한다. CPP의 세포내 투과기전이 엔도싸이토시스에 의한 것인지 확인하기 위해 CPP 그 자체 혹은 운반물질이 연결되어 있는 CPP를 세포에 처리시, 특정 엔도싸이토시스 경로에 해당하는 특이적 저해제를 사용하거나, 엔도싸이토시스 경로에 해당하는 특정 단백질의 Dominant-negative 단백질을 과발현 하거나, 세포를 저온처리(Energy depletion condition)하거나 하는 방식 등으로 실험한 결과, 가장 대표적인 CPP의 하나인 Tat에 GST 혹은 GFP가 연결된 물질의 경우 주로 caveolae 매개 엔도싸이토시스에 의해 세포내로 들어가는 것으로 밝혀졌으며, Tat 자체나 Tat-HA2의 경우 마크로피노싸이토시스에 의해 세포내로 수송되는 것으로 드러났다.
한편, 다른 연구에서는 모든 세포의 엔도싸이토시스 경로를 배제하고자 유전공학기법으로 제작된 clathrin과 caveolae 매개 엔도싸이토시스가 결여된 세포에 저온(energy depletion)에서 arginin-rich의 다양한 CPP를 사용하여 실험한 결과, Tat의 경우 세포내로 이동하는 것이 관찰되는 것으로 보아 Tat의 세포내 이동은 전적으로 엔도싸이토시스만 의존하지 않는다는 결론을 내리기도 했다. 이러한 결과들은 CPP의 세포내 수송이 알려진 엔도싸이토시스 뿐만 아니라 밝혀지지 않은 다른 세포내 수송 경로를 통해 세포내로 수송될 가능성이 있으며, CPP의 세포투과기전은 CPP의 구성 아미노산 종류와 생화학적인 구조에도 영향을 받는 것으로 생각될 수 있다[2, 4].
3. 세포투과성 펩타이드의 활용
질환에 있어 유용한 단백질을 치료목적으로 사용하는 것은 대단히 매력적인 일이다. 그러나 질병의 치료를 위해 단백질과 같은 큰 크기의 물질은 그 구조 및 성질을 유지하면서 세포내로 도입하는 것은 하나의 과제로 여겨져 왔다. 이러한 단백질을 세포내로 전달하기 위해 lipid 혹은 polymer 기반의 운반체(liposome, microparticle, nanoparticle)를 사용하였으나, 단백질의 전달 효율이 매우 낮은 경우가 대부분이었다. 이에 CPP를 이용 다양한 종류의 기능성 단백질(β-galactosidase, eGFP, Bcl-xL, human catalase, human glutamate dehydrogenase, Cu, Zn-superoxide dismutase, NF-κB inhibitor srIκBα, HSP70)과 접합하여 세포에 적용하여 성공적으로 타깃 단백질을 다양한 세포내로 전달한 연구결과들이 있다. 이러한 결과들은 CPP가 종양이나, 면역질환, 대사질환 등에 단백질 기반 치료기법이 적용되어 치료 단백질을 세포내로 도입하는데 활용될 수 있는 강력한 수단임을 보여준다[3-7].
안티센스 올리고뉴클레오타이드를 이용한 기술은 세포내의 특정 유전자를 표적으로 하여 질환의 치료에 적용할 수 있는 기술이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특정 유전자가 특이적으로 작용 가능한 이유는 유전자가 갖는 염기서열 특이성에 기인하며, 세포내로 유입된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 상보적인 염기서열을 갖는 특정한 유전자의 mRNA에 결합하게 되고 RNA와 DNA가 상보적으로 결합된 것을 인식하여 분해하는 효소인 RNaseH에 의해 mRNA가 제거되어 유전자의 발현이 저해된다.
이러한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포내에 도입 시 특정한 유전자만을 타깃하여 제어할 수 있으며 생체에서 면역반응을 유발하지 않는 장점이 있으나, DNA의 특성상 세포내에 도달하기 전에 생체에 다량으로 존재하는 DNase에 의해 분해가 될 수 있으며, 생체내에서 구조적으로 불안정한 요소가 있다. 또한 안티센스 뉴클레오타이드가 타깃하는 조직과 세포내로 운반할 수 있는 기술이 선행되지 않는다면 실제 질병에 적용하여 사용하기 어려운 단점이 있다. 이러한 점을 극복하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 생화학적으로 변형하여 생체내에서의 구조적 안정성을 극대화하기 위한 locked nucleic acids (LNA), Peptide Nucleic Acids (PNA), phosphorodiamidate morpholino oligomer (PMO), hexitol nucleic acids (HNA) 등이 개발되었다.
또한, 세포내로 올리고뉴클레오타이드 혹은 이의 유도체(LNA, PNA, PMO, HNA)의 세포내로 전달하는 문제를 해결하기 위하여 몇몇 연구에서 CPP에 PNA나 PMO를 결합하여 세포내 유전자의 발현을 조절하고자 하는 시도가 있었다. CPP(penetratin)에 PNA를 접합하여 human Bowes 세포에서 galanin 수용체의 mRNA의 발현을 억제한 연구가 있었다. Ampipathic CPP인 MAP에 nociceptin/orphanin FQ receptor mRNA에 상보적인 PNA를 연결하여 CHO세포와 신생 랫드의 cardiomyocyte에 처리하여 타깃 수용체와 관련된 생체반응을 조절한 결과가 있다[3, 4].
다양한 나노운반체(nanocarrier)를 이용한 약물의 전달은 생체내에서의 안정성을 증가시키고, 약동성을 개선하여 그 효능을 극대화 시키고 부작용을 줄이기 위해 연구가 되고 있다. 나노운반체로서 리포좀(liposome)이나 마이셀(micelle)이 주로 사용되고 있고, 이러한 막지질 기반의 나노운반체들에 특정 세포나 분자를 표적할 수 있는 리간드나 분자 이미징을 위한 기능성기의 수식을 통해 질병의 진단과 치료에 적용하고자하는 시도가 행해지고 있다. CPP를 리간드로 이용해 리포좀이나 마이셀을 수식하여 리포좀이나 마이셀에 싸여져 있는 약물 혹은 나노파티클의 세포내로의 전달을 증가하게 하는 연구 결과가 있다[4].
siRNA(small interference RNA)나 shRNA(small hairpin RNA)를 사용한 RNA 저해(RNA interference)는 유전자의 기능을 연구하고 질병의 새로운 타깃 유전자를 발굴하는데 필수적인 방법이다. 그러나 siRNA 역시 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 단점인 세포내로의 수송이 어렵다는 점을 들 수 있다. 이것을 극복하기 위해 바이러스 기반 혹은 다른 전달체를 사용한 다양한 시도가 있었으나, 임상에 적용할만한 수준으로 siRNA를 세포내로 전달하는 방법은 현재 개발되어 있지 않은 실정이다. CPP를 이용한 siRNA의 전달을 위해 CPP를 siRNA와 공유결합 혹은 비공유결합으로 연결하는 방식이 있다. Transportan, Tat, penetratin과의 공유결합에 의해 siRNA를 세포내로 전달하여 특정한 유전자의 발현을 억제한 보고가 있다.
위 실험에서 siRNA와 CPP를 cross-linking한 후 공유결합을 이룬 CPP-siRNA만을 정제하여 사용하지 않은 결과로 실제 공유결합으로 이루어진 CPP-siRNA가 세포내로 들어가 작용을 한 것인지 비공유결합의 siRNA와 CPP의 복합체(complex)가 세포내로 전달되어 작용을 하였는지 분명하지 않으며, 이후 다른 연구에서 정제된 CPP-siRNA를 사용한 결과 상당히 높은 농도로 사용할 경우에만 세포내에서 타깃 유전자의 억제가 관찰되는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과로 최근에서 siRNA와 CPP의 비공유 복합체를 제작하여 siRNA를 세포내로 전달하려는 많은 연구가 이루어지고 있다. 예로 펩타이드 OCT-4를 타깃하는 siRNA와 CPP 비공유결합 복합체를 제작하여 세포에 처리한 결과 OCT-4 뿐만 아니라 OCT-4에 의해 조절되는 유전자인 cyclin B1 역시 발현이 저해되는 것을 관찰하였다. 같은 방식으로 Polyrginine CPP에 VEGF(Vascular endothelial growth factor)를 타깃으로 하는 siRNA의 비공유결합 복합체를 제작하여 이를 세포에 적용 VEGF유전자의 발현을 억제한 사례도 있다. 이러한 비공유결합을 활용하여 CPP-siRNA 복합체를 제작하는 방식은 대부분 음의 전하를 띠는 siRNA와 양의 전하를 띠는 CPP 사이의 정전기적인 상호작용에 기반으로 형성된다. dsRNA 바인딩 도메인(DRBD)을 Tat에 접합하여 이를 siRNA와 상호반응 시켜 비공유결합 복합체를 형성하게 하는 방식이 개발되어 있으며, 이러한 DRBD방식을 활용하여 인간배아줄기세포, T세포 등에 특정 유전자의 발현을 억제한 연구결과가 있다[3, 4].
III. 맺는 말
다양한 연구를 통해 CPP는 다양한 크기와 구조 및 생화학적 성질을 갖는 물질을 세포 안으로 전달하게 하는 물질임이 밝혀졌다. 이러한 CPP는 약리효과를 갖고 있으나 세포내 전달이 어려워 치료제로 개발되지 못했던 다양한 물질의 약물전달시스템으로 활용 가능할 것으로 생각된다.
실제 환자의 치료를 위한 다양한 약물, 올리고뉴클레오타이드, 유전자 치료물질 등이 연구 개발되고 있다. 이러한 치료제 후보 물질의 생체내에서의 전달에 있어 안전하고 재현성이 좋으며 효과적인 약물전달체계의 개발이 필수적이다. CPP가 이러한 약물 및 다양한 물질들을 세포내로 전달하는 효율적인 전달체계로 임상에서 활용되기 위해서는 CPP와 CPP에 의한 물질의 세포내 전달기전이 보다 분명하게 밝혀져야 하며, CPP에 의한 치료물질의 세포내 수송에 있어 해결되어야 할 기술적 과제는 CPP를 통해 세포내로 유입된 약물이나 치료물질의 많은 부분이 엔도좀에 갇혀 세포질 내로 유입되어 작용하지 못하는 점과 CPP가 세포특이성을 갖게 하여 치료하고자 하는 특정 조직과 세포에만 약물이 전달될 수 있게 하는 기술의 개발이 필요하다. 이러한 단점을 극복할 수 있는 기술이 개발된다면 CPP를 이용한 다양한 질환의 치료에 적용될 수 있을 것으로 생각된다.
이러한 CPP와 관련하여 국립보건연구원 인플루엔자바이러스과에서는 2011년 이후 내부연구과제(조류인플루엔자바이러스 Multi Basic Cleavage Site의 세포투과기전연구)의 수행을 통해 이러한 다양한 활용가치를 지니는 신규 세포 투과 도메인을 개발하고자 노력한 결과, 조류인플루엔자바이러스(H5N1, Avian Influenza Virus)의 Hemagglutinin의 Multi Basic Cleavage Site(MBCS)와 RSV(Respiratory Syncytial Virus)로부터 새로운 세포투과성 펩타이드를 개발(국내특허등록: 제 1184915호, 제 1135460호, 발명자 강춘, 이주연, 이화중)하고 이의 응용과 관련된 후속 연구를 진행 중이다.
